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SPE应用一:兽药残留应用
发布时间:2017-10-23   点击次数:1532次

动物组织中盐酸克仑特罗等4种β-激动剂药物残留检测(Cleanert PCX, P/N: CX1506)

1.实验材料

1.1 固相萃取小柱:PCX(150mg/6mL)

1.2 四种β-激动剂药物:盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗、莱克多巴胺等4种β-激动剂药物

2. 试料的制备

取空白样品,经过液液萃取初步处理后,添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。

3。 净化

   依次用甲醇5mL、水5mL30mmol/L盐酸5mL润洗固相萃取小柱,将上述备用液过柱,依次用水5mL、甲醇5mL淋洗,真空抽干,用4%氨化甲醇5mL洗脱PCX小柱,收集洗脱液于具塞玻璃试管中,50下氮气吹干。在样液过柱和洗脱过程中流速控制在1mL/min左右。

4。 衍生化及检测

将上述盛有残渣的具塞玻璃试管放入50烘箱中加热片刻,除去水分后,加入甲苯100mL和双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA100mL,涡旋振荡20s,密封玻璃塞,置于80恒温烘箱中加热l小时,冷却后加入300mL甲苯,作为试样溶液,供气相色谱-质谱分析。

5. 结果

5.1 回收率实验(精密度和准确度)

将猪肝空白样品经过液液萃取初步处理后,分别添加一定量的标准溶液,配制1μg/L2μg/L5μg/L10μg/L100μg/L五个浓度的试样溶液,每批次内同一浓度做5次平行实验,共4个批次(样品典型回收率色谱图见附图)。

猪肝中实验结果列表如下

添加浓度

(μg/L

回收浓度

(μg/L

平均回收值

(μg/L

平均回收率

%

相对标准偏差

%

1

0.75

0。72

72.40

5。93

0.67

0.72

0。70

0.78

2

1。62

1.63

81.30

1.23

1.66

1.60

1.61

1.64

5

4.02

4。24

84。80

4。16

4。10

4。27

4.38

4。43

10

8.24

8.45

84.45

2.81

8。35

8.77

8.62

8。25

100

90.24

9.12

91.15

2.86

87。15

91.77

92.62

93。95

 

5.2重复性实验(批间误差实验):

猪肝中实验结果列表如下

批间

添加浓度(μg/L

1

2

5

10

100

平均

回收率%

RSD%

平均

回收率%

RSD%

平均

回收率%

RSD%

平均

回收率%

RSD%

平均

回收率%

RSD%

1

72.40

5.93

81.30

3.49

84.80

6。16

84。45

3。59

91。15

2.86

2

75.37

6.12

80.47

5.37

84.74

7.55

87.46

4.68

90.05

3.86

3

70.09

7.85

80。80

6.57

83.10

8.17

83.21

5.39

89。53

4。16

4

76.73

4.90

78。50

8。35

82.90

5.11

85。95

5.72

88。27

5.93

平均值

73。65

6.20

80.25

5.95

83.88

6.75

85.27

4.84

89。75

4.20

RSD%

12。95

10。79

9.43

7.00

5.75

 

附图:猪肝中0.5μg/L1μg/L2μg/L5μg/L10μg/L100μg/L六个浓度检测结果总离子流图(TIC)代表图谱:

liver+1ppb(pcx)

猪肉中五种磺胺药物的检测(Cleanert SUL-5, P/N: SUL-5)

一、实验材料

1SPE柱:Cleanert SUL-52g/10mL

2.五种磺胺类药物:磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲唑(SMZ) 磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺喹啉(SQ)

3.标准样品工作液

标准样品根据NY 5029-2001附录E配制,浓度为10mg/kg

 

二、实验过程

1.柱保留回收率实验方法

按照NY 5029-2001附录E中的方法进行柱保留实验。具体步骤为:吸取50µL100µL混合标准工作液于2.95mL2.90mL95%乙腈中溶解,然后过已经5mL95%乙腈活化的SUL-5小柱。具体步骤如下:

1)柱平衡:95%乙腈5mL

2)上样(95%乙腈样品溶液 3mL

3)预淋洗:5mL95%乙腈淋洗

4)洗脱:70%乙腈10mL洗脱

收集洗脱液,进行HPLC分析,进样量为20µL。

2.添加回收率实验

按照NY 5029-2001附录E中的方法进行添加回收率实验。具体步骤为:称取组织样品5g(到0.01g)于已加有10g无水硫酸钠的离心管中,然后加入乙腈25mL,,10000r/min以上的速度均质1min后,以3000r/min的速度离心5min。分离后的残渣再用25mL乙腈处理,以3000r/min的速度离心5 min。合并两次的上清液,加入用正己烷30mL,振荡10min,以3000r/min的速度离心5min,取下层液体,加正丙醇10mL,50下减压干燥至干,残留物用95%乙腈3mL溶解,过碱性氧化铝小柱。用95%乙腈5mL过柱,不收集,再用70%乙腈10mL洗脱后,收集洗脱液进行液相色谱仪测定。

 

3.实验结果与分析

31 柱保留回收率实验

Cleanert SUL-5小柱分别进行了两种浓度的柱保留回收率实验,浓度设置相当于实际样品中含有100µg/kg200µg/kg磺胺类药物,实验结果见表1、表2,从表中可见Cleanert小柱SM2SMMSMZSDMSQ的平均回收率范围分别为92.47~99.37%93.69~99.44%88.61~96.27%90.87~96.06%91.83~95.92%,效果良好;同样从表中可见Cleanert小柱的批内变异系数在0.30~9.38%之间,小柱的稳定性较好。

32 样品回收率实验

Cleanert SUL-5小柱进行了两个浓度的回收率实验,每个浓度6个重复,结果见表3。从表3可知Cleanert小柱在100µg/kg200µg/kg添加浓度下,猪肉中的平均回收率在80.62~94.49%范围内,批内变异系数在3.98~7.79%范围内,回收率高,稳定性好。

 

表1. Cleanert小柱保留回收率实验结果(浓度相当于组织中100µg/kg)

小柱批次

药物种类

回收率(%)     平均回收率 (%)          RSD(%)

*批

 

 

 

 

第二批

 

 

 

 

第三批

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

94.37       96.10      95.19      95.22       0.91

96.97       95.38      96.10      96.15       0.83

89.95       90.96      98.50      93.14       5.01

94.66       98.15      95.08      95.96       1.99

93.48       91.85      90.55      91.96       1.59

94.18       95.49      101.13     96.93       3.81

97。55       88。94      96。90      94。46       5。07

91.73       87.87      94.46      91.35       3.62

87。22       99。60      97。87      94。90       7。06

92.18       94.80      93.17      93.38       1.43

95。08       94。76      94。52      94。79       0。30

99.63       95.11      95.96      96.90       2.48

96。40       98。16      87。26      93。94       6。23

96。79       96。66      94。55      96。00       1。31

96.32       91.38      92.49      91.93       0.85

 

 

表2. Cleanert小柱保留回收率实验结果(浓度相当于组织中200µg/kg)

小柱批次

药物种类

回收率(%)              平均回收率 (%)    RSD(%)

第三批

 

 

 

 

第四批

 

 

 

 

第五批

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

99.66       99.26      98.75     99.22         0.46

97.46      100.25      96.37     98.03         2.04

96.35       94.42      97.06     95.94         1.42

94。97       94。86      98。34     96。06         2。06

98.22       91.96      97.59     95.92         3.59

100.45      85.90      91.06     92.47         7.97

94。67       88。58      97。83     93。69         5。02

95.96       81.25      88.63     88.61         8.30

99.83       82.87      89.90     90.87         9.38

96.21       87.89      91.40     91.83         4.54

98.69       100.31     99.11     99.37         0.85

101.51      100.78     96.04     99.44         2.99

91。35       98。78      98。68     96。27         4。43

92.75       97.29      97.88     95.97         2.92

84.27       98.61      98.20     93.69         8.71

 

 

              表3. Cleanert小柱猪肉样品回收率实验结果

添加浓度(µg/kg

药物种类

回收率(%)                     平均回收率 (%)  RSD(%)

100

 

 

 

 

200

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

93.39   97.95   98.87   90.33   98.27   88.14   94.49   4.83

97。46   90。66   94。33   81。83   93。64   96。50   92。40   6。17

83.78   88.45   94.40   80.24   82.04   80.30   84.87   6.56

91。26   96。75   91。79   87。57   85。88   88。43   90。28   4。30

88。44   85。14   92。61   81。03   79。57   83。59   85。06   5。69

80.85   77.37   88.39   90.53   73.80   81.17   82.02   7.79

91.79   88.87   96.23   92.96   87.01   87.36   90.70   3.98

79。60   77。27   87。34   86。98   75。44   82。47   81。52   6。09

84.31   72.35   84.52   81.92   82.53   78.10   80.62   5.79

91.93   81.86   91.83   87.89   86.90   86.17   87.76   4.33

 

 

水产品、进口肉中土霉素、四环素、金霉素含量检测方法(Cleanert PS, P/N: PS2003)

 

1SPE柱:Cleanert PS柱(200mg/3mL

2.样品处理

称取5g经匀浆处理的样品于100mL离心管内,分别加入含有EDTA2Na的柠檬酸缓冲液30mL20mL,混合震荡提取,合并上清液。加入20mL正己烷和上清液于分液漏斗中,充分混合震荡5min,合并下层。

含有EDTA2Na柠檬酸缓冲液的配制0。1mol/L柠檬酸缓冲溶液307mL0.5mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液193mL混合均匀,向其中加入1.86gEDTA2Na,溶解后作为样品提取液。

3.净化步骤:

10mL甲醇,10mL水,5mL EDTA2Na活化PS柱,加入上清液,然后以10mL水淋洗小柱,抽干,zui后以10mL甲醇洗脱目标物,并收集。

4.浓缩及定容:

浓缩:在旋转蒸发仪上减压浓缩,温度小于40

定容:加入1。0mL1。36%的磷酸二氢钾溶液,将定容液进行HPLC分析

5HPLC条件

色谱柱:Venusil MP C18, 5µm,4.6*250mm

流动相:A:B=77:23

A:咪唑缓冲液称取68.08咪,10.72乙酸镁,0.37EDTA2Na 溶于800mL水中,用冰乙酸调pH7.2,加水定容到1000mL.

B:乙腈

6.结果:(两个平行)

名称

回收率-1

回收率-2

土霉素

128%

137%

四环素

91。8%

97。4%

金霉素

88.5%

87.1%

强力霉素

97。3%

95.3%

                                                                                                                                                                     

蜂蜜中四环素检测(Cleanert PEP,Cleanert COOH,P/N:PE5006,CH5003)

  1. 样品制备:称6g蜂蜜样品+30mL提取液(PH=4.0),旋涡振荡

提取液配制:柠檬酸10.5g+磷酸氢二钠(无水)8.88g+乙二胺四乙酸钠30.3g+820mL水,用2M HClPH4.0

2SPE步骤

PEP(500mg/6mL)

   活化:甲醇,水

   上样:把样品提取液过柱

   淋洗:5%甲醇/ 5mL,抽干

COOH(500mg/3mL)

  活化:乙酸乙酯,2柱管

PEP(上)-COOH(下) 串联

 淋洗: 15mL乙酸乙酯淋洗,拿下PEP柱,COOH柱抽干(5min

 洗脱: 流动相(0.01M草酸:乙腈:甲醇=350100504.5mL

 定容: 洗脱液用0.01M草酸定容至5mL,摇匀,过滤膜,UPLC测定。

硝基呋喃类代谢物残留量的LC/MS测定方法 (Cleanert PEP,P/N:PE0603)

1.材料:SPE柱:PEP(60mg/3mL)

2.样品制备

21 奶粉和牛奶样品处理

2.1.1 样品处理:奶粉1g(牛奶称5g),加15 mL三氯乙酸-水混合溶液(2+15mol,加内标,加混标,37。5水浴水解5小时,取出后4000 rpm离心5min,取上清液待用。

2.1.2  样品初步净化及衍生:PEP柱以5mL甲醇,5mL水活化,后把2.1.1处理好的上清液过柱,待样液全部通过固相萃取柱后用5ml的三氯乙酸淋洗全部收集到另一个管中,加100μl衍生剂(20mg而硝基苯甲醛溶于1ml二甲亚砜),放入37.5水浴中衍生16小时(过夜)。

22 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品和蜂蜜样品处理

2.2.1样品粗处理:猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品称2g(蜂蜜称5g),加入15mL甲醇-水混合溶液(2+1),涡旋,混匀, 4000 rpm离心5min,吸取上清液,加入内标及混标。

2.2.2 衍生:在上述上清液中加100μL衍生剂(20mg而硝基苯甲醛溶于1mL二甲亚砜),放入37.5水浴中衍生16小时(过夜)。加磷酸氢二钾缓冲液5mLpH约为7.4),4000 rpm离心10 min,(若待测样品含脂肪较多,上清液加5 mL正己烷,振荡2 min4000 rpm离心10 min吸取并弃掉正己烷)

3PEP柱净化

1) 活化:PEP柱以5mL甲醇,5mL水活化

2) 上样:将2.2.12.2.2中的衍生液加磷酸氢二钾缓冲液5ml,用1mol/l氢氧化钠溶液调节溶液pH约为7.44000 r/min离心10 min,上清液(若待测样品含脂肪较多,上清液加5 mL正己烷,振荡2 min,4000 r/min离心10 min吸取并弃掉正己烷)以小于2 mL/min的流速通过PEP

3) 淋洗:以10 mL水洗涤固相萃取柱,弃去全部流出液。用真空泵在65 kPa负压下抽干PEP固相萃取柱15 min

4) 洗脱:用5 mL乙酸乙酯洗脱被测物于25 mL棕色离心管中。

5) 浓缩:洗脱液在40水浴中氮气吹干,用样品定容液溶解并定容至1.0 mL,混匀后过0.2μm滤膜用液相色谱-串联质谱测定。

 

动物性食品中糖皮质激素类药物多残留LC/MS检测方法 (Cleanert Silica, P/N:SI5006)

1.固相萃取柱:Cleanert Silica,500mg/6ml

2.提取

2.1肌肉组织样品

称取组织试料5g±0.05g)于50mL离心管中,加30mL乙酸乙酯, 10g无水硫酸钠,均质1min200r/min摇床振动20 min,4200r/min离心10min,移取乙酸乙酯层。残渣中加乙酸乙酯25mL, 均质1min,200r/min摇床振动20 min4200r/min离心10min,移取乙酸乙酯层。合并两次提取液,40旋转至近干,加乙酸乙酯1mL和正已烷5mL,溶解残渣,待净化。

 2。2 牛奶、鸡蛋样品

称取牛奶或鸡蛋试料5g±0。05g)于50mL离心管中,加30mL乙酸乙酯,均质1min200r/min摇床振动20 min,4200r/min离心10min,移取乙酸乙酯层。残渣中加乙酸乙酯25mL,均质1min200r/min摇床振动20 min,4200r/min离心10min,移取乙酸乙酯层。合并两次提取液,40℃旋转至近干,加乙酸乙酯1mL和正已烷5mL,溶解残渣,待净化。

3.净化

   用正已烷6mL活化Silica,提取液过柱。用正已烷6mL淋洗萃取柱,抽干,用正已烷-丙酮(6/4,V/V)6mL洗脱。洗脱液50氮气吹干,加20%乙腈水溶液0。5mL,溶解残渣,转入1。5mL离心管中,4200r/min离心20min,取上清液,过0.22um滤膜,供液相色谱-串联质谱法测定。

 

动物源食品中玉米赤霉醇类药物残留LC/MS检测 (Cleanert NH2, PAX, P/N:NH5006, AX1506)

1.SPE柱:Cleanert NH2:500mg/6mL, PAX: 150mg/6mL

2.样品处理

2.1肌肉组织样品

 2.1.1 提取:称取5g±0。05g)于50mL离心管中,加甲醇15mL,涡旋1min,4000r/min离心10min,取上清液于另一离心管中。重复提取一次,合并两次提取液。加正已烷20mL,手摇20次,3000r/min离心5min,弃上层正已烷。再加正已烷20mL重复脱脂一次。下层转至100mL鸡心瓶中,50旋蒸至近干,加乙酸乙酯5mL,涡动1min,静置10s,上清液转移至同一个离心管。再用正已烷10mL洗涤鸡心瓶一次,合并三次残余物溶解液,备用。

2。1。2净化:氨基柱上加无水硫酸钠2g,用玻璃棒敲匀。依次用乙酸乙酯和正已烷各5mL活化,取备用液全部过柱,再依次用正已烷、正已烷-乙酸乙酯(60+40,v/v)5mL淋洗。依次用正已烷-乙酸乙酯(20+80,V/V)和乙酸乙酯各4mL洗脱,合并两次洗脱液,50氮气吹干。

2.1.3净化:残余物中加乙腈0。5mL,涡动1min,加水0。5mL,混匀,过0。2um有机滤膜,供液相色谱-串联质谱仪测定。

2.2 肝脏组织样品

2.2.1 称取5g±0.05g)于50mL离心管中,加甲醇10mL,涡旋1min,4000r/min离心5min,取上清液于另一离心管中。重复提取一次,合并两次提取液。加正已烷10mL,手摇20次,3000r/min离心5min,弃上层正已烷。下层于50氮气吹干,加乙酸乙酯5mL,涡动1min,再加正已烷20mL涡动30s, 4000r/min离心5min,取上清液备用。

2.2.2 净化:氨基柱上加无水硫酸钠2g,用玻璃棒敲匀。依次用乙酸乙酯和正已烷各5mL活化,取备用液全部过柱,再依次用正已烷、正已烷-乙酸乙酯(45+55,v/v)5mL淋洗。依次用正已烷-乙酸乙酯(20+80,V/V)和2%甲醇乙酸乙酯各5mL洗脱,合并两次洗脱液,50氮气吹干。

2.2.3净化:残余物中加乙腈0.5mL,涡动1min,加水0.5mL,混匀,加正已烷2mL,涡动30s,9000r/min离心5min,取下层清液,过0。2um有机滤膜,供液相色谱-串联质谱仪测定。

2.3 牛奶样品

2。3。1 提取:量取5。0mL试料于50mL离心管中,加18%的硫酸溶液0。1mL,涡匀,静置10min,加正已烷10mL和乙腈20mL300r/min振荡10min,4000r/min离心10min,弃正已烷层。取提取液12.5mL于离心管中,50氮吹至小于0.1mL。加水10mL,5mol/lNaOH调节Ph值至119000r/min离心5min,备用。

2.3.3 净化:Cleanert PAX固相萃取柱依次用甲醇、水各2mL活化和平衡,将备用液过柱,依次用甲醇-氨水-水(5+5+90,V/V/V1mL和甲醇0。5mL洗涤,用2%乙酸乙腈4mL洗脱,收集洗脱液,50下氮气吹干。

2.3.3净化:残余物中加乙腈0.5mL,涡动1min,加水0.5mL,混匀,过0.2µm有机滤膜,供液相色谱-串联质谱仪测定。

2.4 鸡蛋样品

2。4。1提取:称取5g±0.05g)于50mL离心管中,加乙腈10mL,涡动1min,9000r/min离心5min,取上清液于另一立新观众。重复提取一次,合并两次提取液。取12。5mL于离心管中,50氮吹至小于0.1mL。加水10mL,5mol/lNaOH调节Ph值至119000r/min离心5min,备用。

2。4。2净化:Cleanert PAX固相萃取柱依次用甲醇、水各2mL活化和平衡,将备用液过柱,依次用甲醇-氨水-水(5+5+90,V/V/V1mL和甲醇0.5mL洗涤,用2%乙酸乙腈4mL洗脱,收集洗脱液,50下氮气吹干。

2.2.3净化:残余物中加乙腈0.5mL,涡动1min,加水0.5mL,混匀,过0.2µm有机滤膜,供液相色谱-串联质谱仪测定。

 

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